实验海洋生物学重点实验室知识库

        CRISPR/Cas9是新一代基因编辑技术，在生物学基础研究与遗传育种领域正迅速得到应用。大型海藻是我国重要的海水养殖对象，具有突出的研究价值和经济价值，但基因编辑技术尚未建立。浒苔（Ulva prolifera）属于大型绿藻，其生活史周期短便于调控、具有多种繁殖再生方式、能够在封闭水体中高效增殖，特别是浒苔的细胞核与叶绿体遗传转化技术均已系统建立，因此，浒苔是开展大型海藻基因编辑技术的理想实验材料。

    本文以浒苔为材料，围绕靶基因的克隆、靶基因的基因编辑、以及后续基因编辑技术验证平台的建立三个方面，系统建立了浒苔CRISPR/Cas9基因编辑技术，取得以下研究进展：

    首先，在浒苔中克隆得到硝酸还原酶基因并完成功能验证。根据缘管浒苔转录组数据，通过RACE（Rapid amplification of cDNA ends）和染色体步移克隆了UpNR基因。发现UpNR基因包括六个内含子和七个外显子，编码863个氨基酸，包括NR的全部五个重要功能域和21个重要活性残基。通过qPCR验证了UpNR基因功能，阐明了多种氮源条件下UpNR的表达特征。UpNR基因的克隆与功能验证为建立浒苔CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了一个理想的靶基因位点。

    其次，在浒苔中成功实现UpNR基因的CRISPR/Cas9基因编辑。我们针对UpNR基因设计了系列sgRNA，通过体外介导靶基因编辑验证了的活性；优选高活性sgRNA构建了系列基因敲除载体，利用浒苔遗传转化体系完成了载体导入，成功检测到cas9基因和sgRNA在浒苔体内的转录；接下来，经氯酸盐和草丁膦筛选成功获得了抗性藻株；最后，使用PCR-RE、Sanger测序、高通量测序等多种分子检测方法，检出六种基于Indels突变的UpNR突变型。成功实现UpNR的基因编辑，标志着在浒苔中首次建立了基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法。

    最后，我们解析了浒苔类胡萝卜素合成通路。克隆了浒苔八氢番茄红素合成酶基因（UpPSY）、八氢番茄红素脱氢酶基因（UpPDS）、ζ-胡萝卜素脱氢酶基因（UpZDS）和β-胡萝卜素环化酶基因（UpLCYb），分别解析了其基因结构。通过遗传互补实验分别验证了上述四个基因的功能。表达分析结果显示，在转录水平，UpPSY、UpPDS、UpZDS明显受光的诱导，受营养盐条件的变化影响不大；与之相反，UpLCYb基因受光诱导不明显，反而在营养缺陷条件下有较强表达。

    综上所述，本文克隆了首个大型绿藻氮代谢基因——UpNR，并以UpNR为靶基因，首次在大型海藻中实现了基于CRISPR/Cas9的基因编辑。同时，首次在大型海藻中解析了类胡萝卜素合成通路，将为开展基于CRISPR/Cas9的基因敲除、单碱基编辑、基因表达调控等技术方法的应用评价提供重要的靶向位点。