白斑综合征病毒（WSSV）三种重要囊膜蛋白的重组表达及在病害防控中的作用

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	白斑综合征病毒（WSSV）三种重要囊膜蛋白的重组表达及在病害防控中的作用
	孙玉苗
学位类型	博士
导师	相建海
	2011-05-23
学位授予单位	中国科学院研究生院
学位专业	海洋生物学
关键词	白斑综合症病毒（wssv） Vp28 活菌载体脊尾白虾 Vp281
摘要	由白斑综合征病毒（WSSV）引起的白斑综合症自从20世纪90年代初在东亚爆发以来，迅速蔓延至全球，造成了巨大的经济损失，成为危害虾产业最严重的传染性病毒病。迄今没有有效的策略防控该病毒。病毒囊膜蛋白在与宿主细胞受体相互作用，启动病毒感染的发生或介导病毒的侵入方面起着重要作用。WSSV囊膜蛋白导入虾体内，能够起到保护宿主抵抗WSSV的效果。这一防控WSSV的策略成为近年研究的热点。本研究对使用活的大肠杆菌（Escherichia coli）作为病毒囊膜蛋白递送入虾体内的载体的WSSV防控策略做了探索；同时对两个WSSV囊膜蛋白VP281和VP31的功能做了初步观察判断。研究主要包括以下内容和结果。 1．本研究选择WSSV囊膜蛋白VP28，选用一种组成分泌型表达质粒pBTA1作为表达工具，使用活的大肠杆菌菌株DH5α作为递送载体，构建了表达VP28全长和膜外区的重组大肠杆菌，分别命名为DhpV和DhpVB。对两种重组菌的表达情况进行分析，结果显示二者皆能够组成型地表达目的蛋白，并顺利地把目的蛋白递送至胞外培养基中。 2．为了检验其保护潜力，向脊尾白虾（Exopalamon carincaudaHolthuis）中注射表达VP28的重组活菌DhpVB三次，在后两次导入重组活菌DhpVB的同时进行攻毒；使用含有空载体pBTA1的大肠杆菌作为对照。首次攻毒后，DhpVB和不带VP28的大肠杆菌在保护效果方面没有显著差别。第二次攻毒后，重组菌DhpVB显示出明显强于不带VP28的大肠杆菌的保护效果；重组菌DhpVB的抗性指数（Resistance index，RI）平均为0.67±0.08，不带VP28的大肠杆菌的RI为0.41±0.09；差异显著（P﹤0.05）。 3．使用pET-30a(+)为表达载体，使用大肠杆菌菌株BL21 (DE3) pLysS为表达菌株，以包涵体的形式表达了WSSV囊膜蛋白VP28、VP281和VP31并使用螯合Ni2+的琼脂糖凝胶柱对包涵体蛋白进行了纯化。使用梯度透析去除尿素的方法对目的蛋白进行复性。这为以后探索VP281和VP31是否也同VP28一样具有保护宿主抵抗WSSV作用打下基础。 4．尝试利用组成分泌型原核表达质粒pBTA1为表达载体，构建表达囊膜蛋白VP28、VP281或VP31的重组大肠杆菌菌株DH5α。组成型分泌rVP28和rVP281的重组菌构建成功，但含rVP281的重组菌与含rVP28的重组菌相比生长十分缓慢，推测rVP281的表达可能抑制大肠杆菌的生长。而组成型分泌rVP31的重组菌的构建未获成功。为弄清组成型分泌rVP31的重组菌未能成功构建的原因，使用pET-30a(+)为表达载体，构建了表达rVP31包涵体的重组菌株BL21 (DE3) pLysS。将rVP31蛋白纯化并复性后，采用牛津杯法，检测rVP31蛋白的抗菌活性。以溶壁微球菌为受试菌，出现抑菌圈，表明rVP31对其具有抗菌作用。使用活的大肠杆菌有利于囊膜蛋白在虾体内的驻留；使用分泌型表达载体利于囊膜蛋白和虾的直接接触和相互作用。而且遗传背景清楚、大规模培养经济的大肠杆菌还可作为免疫增强剂增强保护效果。表达VP28的重组活菌在同虾发生足够的相互作用的条件下，能够提高虾抵抗WSSV的能力。本研究为防控WSSV提供了一个新的参考。另外，本研究首次观察到重组的WSSV囊膜蛋白VP281和VP31具有抗菌作用，增加了WSSV病毒学方面的知识。
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17819
专题	实验海洋生物学重点实验室
推荐引用方式 GB/T 7714	孙玉苗. 白斑综合征病毒（WSSV）三种重要囊膜蛋白的重组表达及在病害防控中的作用[D]. 中国科学院研究生院,2011.

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白斑综合征病毒（WSSV）三种重要囊膜蛋（6037KB）			限制开放	CC BY-NC-SA	浏览