中国明对虾抗脂多糖因子的多态性及其功能活性研究

IOCAS-IR > 实验海洋生物学重点实验室

	中国明对虾抗脂多糖因子的多态性及其功能活性研究
	郭书悦
学位类型	硕士
导师	李富花
	2014-05
学位授予单位	中国科学院研究生院
学位授予地点	北京
学位专业	海洋生物学
关键词	对虾抗脂多糖因子 Lps结合域抑菌活性抗wssv活性
其他摘要	对虾是我国重要的海水养殖品种之一，以其较高的营养和经济价值，在我国的海水养殖中占有重要地位。然而近年来由多种细菌、病毒导致的虾病频发成为了对虾养殖业的一大困扰，导致严重的经济损失。虽然抗生素能有效地杀灭多种细菌，但它的滥用却会使水产病原菌的抗药性日益增加，不仅不利于养殖业的可持续发展，还会造成环境污染，药物残留，对食品安全产生较大的负面影响。抗菌肽是一种多肽型抗生素，在无污染和不易产生耐药性方面比传统抗生素更具有优势，并且一些抗菌肽也能够抑制病毒的活性，因此其在病害防治中具有重要的应用前景。抗脂多糖因子（Anti-lipopolysaccharide factor，ALF）作为对虾体液免疫体系中的一种重要抗菌肽，与对虾的抗病菌、抗病毒过程密切相关。因此对对虾抗脂多糖因子的研究在对虾的养殖生产中具有重要的意义。在实验室前期获得了中国明对虾（Fenneropenaeus chinensiss）7种形式的抗脂多糖因子（FcALF1-6和ALFFc）的全长cDNA序列的基础上，本论文对比分析了它们在对虾组织中的分布特点和在对虾受病原刺激或感染后的时序表达变化特征，并通过比较不同亚型的FcALF的抗菌及抗病毒活性，探究其序列结构差异对功能活性的影响，以期在此基础上通过相应的结构改造构建出功能高效、结构简单、成本低廉的抗菌抗病毒分子，为虾病的防预和治疗、抗菌肽的有效应用及抗菌产品的开发提供一些参考，促进对虾免疫机制的研究。取得的主要结果如下： 1、中国明对虾7种抗脂多糖因子的组织分布模式各不相同。FcALF1集中表达在消化器官胃中；FcALF2集中表达在淋巴器官（Oka）、神经组织、鳃和眼柄中都有较高的表达量；FcALF3集中表达在Oka中；FcALF4和FcALF5集中表达在眼柄中；FcALF6则在Oka、神经组织和血细胞中有相对较高的表达；ALFFc集中表达在Oka和血细胞中。其中，FcALF1在胃中的大量表达表明FcALF1可能主要对来自消化器官中的病菌产生抵抗作用；FcALF2和FcALF6在神经中的较高表达表明神经系统也有可能协同调控着对虾的免疫反应。另外，在实验虾受细菌刺激后，7种中国明对虾抗脂多糖因子的表达量都分别表现出不同程度的上调或下调变化。中国明对虾7种抗脂多糖因子的不同组织表达模式和对病菌刺激的响应变化说明抗脂多糖因子的不同亚型很可能在对虾机体内发挥着各自不同的作用，共同参与对虾的免疫反应，保护虾体以抵御多种病原的侵害。 2、本研究尝试用大肠杆菌表达系统对中国明对虾7种亚型的抗脂多糖因子进行原核重组表达，结果表明，多数FcALF亚型的成熟肽在原核表达系统的表达情况并不理想。其中FcALF1、ALFFc对应的重组表达菌在经IPTG诱导后，菌体裂解，无法获得足量的重组蛋白，说明诱导表达出的重组蛋白很可能对大肠杆菌具有很强的抑菌活性。 3、中国明对虾抗脂多糖因子的各种亚型的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）结合域合成肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有不同的抑菌活性，说明抗脂多糖因子的LPS结合域在其功能活性中发挥着重要作用。其中，ALFFc相应的LPS结合域合成肽对实验中的四种测试菌都表现出较明显的抑菌活性，其对藤黄微球菌和鳗弧菌的MIC值范围分别为1-2 μM和2-4 μM。合成肽相应的结构改造体的抗菌活性对比结果显示，当LPS结合域的二硫键打开后，多肽对测试菌的抑菌活性明显减弱甚至消失，表明二硫键在中国明对虾抗脂多糖因子的抗菌功能活性中发挥着关键作用。当LPS结合域中的碱性氨基酸被替代后，多肽对测试菌的抑菌活性也同样消失，并且增加LPS结合域序列中的碱性氨基酸含量，其对测试菌的抑菌活性则大幅增强，说明碱性氨基酸在中国明对虾抗脂多糖因子的抑菌活性中也起着重要作用。 4、利用脊尾白虾作为实验动物检测了不同的合成多肽对WSSV活性的影响。将白斑综合征病毒（White spot syndrome virus, WSSV）预先与FcALF1、FcALF2、FcALF5、ALFFc对应的LPS结合域多肽孵育后再感染脊尾白虾，结果实验虾体内WSSV的拷贝数量显著低于对照组，说明FcALF1、FcALF2、FcALF5、ALFFc的LPS结合域多肽对WSSV的活性有明显的抑制作用。利用结构经过改造的多肽与WSSV孵育，再用孵育过的WSSV感染脊尾白虾，实验表明，当LPS结合域的二硫键打开后，其对WSSV活性的抑制并未减弱，说明二硫键的环状结构并不是中国明对虾抗脂多糖因子LPS结合域发挥其抗WSSV的关键结构；当LPS结合域中的赖氨酸被替代后，其抑制WSSV增殖的活性消失，说明赖氨酸可能在中国明对虾抗脂多糖因子的抗WSV活性中起着关键作用。
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/18008
专题	实验海洋生物学重点实验室
推荐引用方式 GB/T 7714	郭书悦. 中国明对虾抗脂多糖因子的多态性及其功能活性研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院,2014.

条目包含的文件
文件名称/大小	文献类型	版本类型	开放类型	使用许可
中国明对虾抗脂多糖因子的多态性及其功能活（2679KB）			限制开放	CC BY-NC-SA	浏览