实验海洋生物学重点实验室知识库

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）提供了世界上超过70%的虾类总产量， 在海水养殖产业中占有举足轻重的地位。在过去的数十年中，人们做出了大量的 努力来改善凡纳滨对虾的经济性状，包括生长速度、抗病性、耐高温、耐高盐等。 在这些性状中，生长性状的改良一直是对虾选育的重点。对虾体重、体长等生长 性状呈现较高的遗传力，高于人工养殖的陆生动物。在水产动物中，随着高通量 SNP 分型技术的发展，越来越多与经济性状相关的 QTL 和基因被定位和发掘， 然而甲壳动物生长相关基因的鉴定和功能研究较少。 生长性状是复杂的基因网络调控的结果，受到多方面因素影响，本研究通过 筛选生长相关通路上的基因，结合对虾基因组、转录组和重测序数据，获得了一 批生长候选基因。随后在生长速率不同的凡纳滨对虾个体中进行 SNP 位点分析 和验证，鉴定得到两个生长相关候选基因LvBAMBI和LvALS11。我们克隆并分 析了这两个基因的结构、系统发生和表达模式，通过RNA干扰技术敲降了这两 个基因的表达，并分析了敲降后其生长表型及相关基因表达的变化，同时结合转 录组、代谢组数据分析，发现这两个基因通过调控多种生理生化过程来影响对虾 的生长。论文主要研究结果如下： （1）对虾生长性状候选基因筛选。基于基因组和转录组数据，本研究筛选 了可能与生长相关的信号通路包括胰岛素通路、TGF-β通路等在内的10条通路 上的基因共 428 个。通过与对虾基因组比对筛选出有注释的基因 188 个。将这 188 个基因在已有的所有重测序家系（220个个体）SNP数据集中进行比对，统 计各基因上的不同位点的突变频率，筛选出SNP突变频率高(根据异义突变和移 码突变等主要有义突变个数和频率)的基因74个。查找这74个基因的基因组注 释，结合SMART结构域预测、Blast等方法分析其功能，进一步筛选出SNP变 异频率高的基因25个。本研究先在不同生长速率对虾养殖群体的转录组数据中 进行了差异表达分析，筛选到9个在肌肉中存在差异表达的基因，随后按一定的 标准（等位基因频率在0.05-0.95之间）提取了这些基因的SNP位点数据，并分 析了其基因型与表型的关联。同时，选择了上述25个生长候选基因的部分SNP 位点在对虾21253生长差异家系进行了扩增验证。经以上筛选，最终BAMBI和 ALS-like 两个基因被鉴定为生长基因，后续进行基因结构分析和功能验证。 （2）对虾生长基因LvBAMBI和LvALS11的结构和表达分析。本研究从凡纳 滨对虾基因组和转录组数据中筛选出所有被注释为BAMBI和ALS-like的基因序 列，并对目的序列的基因结构、系统发育进行了分析；依据序列的保守结构域和 同其他物种相关序列在发育树上的位置来鉴定各基因；通过多序列比对确定保守氨基酸位点和 motif；预测了转录因子结合位点，从而进一步分析各基因功能； 同时根据两个基因在不同发育阶段、不同蜕皮时期、不同组织中的表达，确定各 自基因的表达模式。最终将这两个基因分别命名为LvBAMBI 和LvALS11。 （3）双链 RNA 活体干扰实验。为了研究这两个基因在对虾生长中的功能， 本研究以养殖阶段的亚成体凡纳滨对虾为实验材料，对LvBAMBI 和LvALS11进 行活体双链 RNA干扰实验。干扰后的实验样品用实时荧光定量 PCR 检测干扰 效率，并进行体重和体长测量。通过对干扰两周后的实验组的生长性状分析发现， dsBAMBI 组的体重增加量和体长增加量均显著低于两个对照组（PBS 组和 dsEGFP 组），其中体重增加量仅为PBS组的68% (p<0.05)，为EGFP组的55% (p<0.05)，体长增加量为PBS组的78% (p<0.05)，为EGFP组的52% (p<0.05)。 同时 dsALS11 组的体重增加量和体长增加量也均低于两个对照组，其中体重增 加量为PBS 组的74% (p<0.05)，为 dsEGFP 组的 83% (p<0.05)，体长增加量为 PBS 组的84% (p<0.05)，为 EGFP 组的 73% (p<0.05)。该结果表明 LvBAMBI 和 LvALS11 均为对虾生长重要相关基因，它们的表达被敲降后对虾生长受到抑制。 （4）生长基因LvBAMBI和LvALS11的作用机制分析。为了进一步研究这两 个基因对对虾生长的调控作用，本研究将干扰后的样品进行了转录组测序和代谢 组分析。通过转录组和代谢组等多组学联合分析结果显示LvBAMBI通过调控脂 代谢和糖代谢来影响对虾生长，其被敲降以后会首先导致脂代谢受阻，进而无法 为机体提供足够的能量，此时会出现增强糖酵解等糖代谢过程来补足这部分能量 的一个代偿机制。从转录组分析结果来看，LvALS11 被敲降以后，差异基因的 KEGG通路富集结果显示，上调的差异基因主要富集到了如糖原合成等糖代谢通 路上，这表明其可能通过调控糖代谢来影响对虾的生长。在糖代谢相关通路上， 本研究发现编码α-淀粉酶(Alpha-amylase)和麦芽糖酶(Maltase-glucoamylase)的 基因表达量显著上调。同时，也发现PCK和UGP2基因表达上调，它们分别在 糖异生途径和糖原生物合成过程中起重要作用。综合上述结果，这两个基因均为 生长促进基因，主要通过调控脂代谢和糖代谢来影响对虾生长。 本研究通过SNP 位点关联生长相关性状的方法寻找和鉴定生长基因，为对 虾生长性状相关基因的筛选和鉴定提供了新的途径，为深入研究甲壳动物生长调 控机制提供了新的线索。此外，通过该方法鉴定到的生长相关基因的 SNP 位点 可以作为分子标记辅助选择育种，为凡纳滨对虾的良种选育提供分子数据支持。

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目  录                                        

第1章 绪论... 1

1.1 凡纳滨对虾生长相关基因研究现状... 1

1.1.1 凡纳滨对虾简介... 1

1.1.2 高通量测序技术... 2

1.1.3 GWAS、eQTL定位及反向遗传学方法... 3

1.2 BAMBI研究进展... 5

1.2.1 BAMBI与TGF-β通路... 5

1.2.2 BAMBI与Wnt通路... 6

1.2.3 BAMBI基因研究现状... 7

1.3 对虾ALS家族研究进展... 7

1.3.1 ALS结构和功能... 7

1.3.2 ALS的研究进展... 8

1.4 本研究的目的和意义... 9

第2章 凡纳滨对虾生长性状候选基因的筛选... 11

2.1 材料与方法... 11

2.1.1 对虾重测序数据集建立... 11

2.1.2 实验动物... 11

2.1.3 对虾21253生长家系和生长群体组织取样... 12

2.1.4 主要试剂及实验仪器... 12

2.1.5 实验所需引物序列... 13

2.1.6 生长相关基因筛选和验证过程... 13

2.1.7 统计分析... 14

2.2 结果和分析... 14

2.2.1 对虾生长相关基因筛选及鉴定... 14

2.2.2 SNP位点特异性验证序列提取... 18

2.2.3 对虾生长群体转录组差异表达分析及SNP位点分析... 19

2.2.4 21253家系中的SNP位点验证... 22

2.3 讨论... 23

2.3.1 通过SNP关联生长性状寻找和鉴定生长相关基因... 23

2.3.2 寻找和鉴定凡纳滨对虾生长相关基因的意义... 24

第3章 凡纳滨对虾生长基因BAMBI结构和功能研究... 25

3.1 材料与方法... 25

3.1.1 实验动物... 25

3.1.2 组织取样... 25

3.1.3 实验仪器、试剂... 25

3.1.4 引物序列... 26

3.1.5 序列鉴定和分析... 26

3.1.6 多序列比对和系统发生树构建... 27

3.1.7 LvBAMBI的基因表达谱分析... 28

3.1.8 LvBAMBI的转录因子结合位点预测... 28

3.1.9 总RNA提取和cDNA合成... 28

3.1.10 基因克隆... 28

3.1.11 双链RNA（dsRNA）合成和RNA干扰... 29

3.1.12 RNA干扰后的转录组测序... 32

3.1.13 实时荧光定量PCR.. 33

3.1.14 代谢组与脂质组联合分析... 33

3.1.15 统计分析... 34

3.2 实验结果... 34

3.2.1 LvBAMBI序列特征... 34

3.2.2 LvBAMBI的系统发育分析... 36

3.2.3 LvBAMBI的转录因子结合位点预测... 38

3.2.4 LvBAMBI的基因表达模式分析... 38

3.2.5 LvBAMBI的RNA干扰... 39

3.2.6 LvBAMBI敲降后的基因表达变化... 40

3.2.7 LvBAMBI敲降后对对虾脂代谢的影响... 45

3.2.8 LvBAMBI敲降后对对虾糖代谢的影响... 46

3.3 讨论... 49

3.3.1 LvBAMBI的结构和表达分析... 49

3.3.2 LvBAMBI对生长的影响... 50

3.3.3 LvBAMBI对糖代谢和脂代谢的影响... 51

3.3.4 本研究的意义... 52

第4章 凡纳滨对虾生长基因ALS11的鉴定、分类和功能分析... 53

4.1 材料与方法... 53

4.1.1 实验动物... 53

4.1.2 组织取样... 53

4.1.3 主要试剂及实验仪器... 53

4.1.4 实验所需引物... 53

4.1.5 凡纳滨对虾ALS家族基因成员鉴定... 54

4.1.6 ALS家族基因成员多序列比对及系统发生树构建... 54

4.1.7 凡纳滨对虾ALS家族基因结构与保守基序分析... 54

4.1.8 LvALS11的基因表达谱分析... 55

4.1.9 LvALS11的转录因子结合位点预测... 55

4.1.10 总RNA提取和cDNA合成... 55

4.1.11 基因克隆... 55

4.1.12 dsRNA合成和RNA干扰... 55

4.2 结果和分析... 55

4.2.1 ALS家族基因序列特征... 55

4.2.2 ALS基因家族分析及鉴定... 56

4.2.3 ALSs的蛋白质三维结构预测... 58

4.2.4 LvALS11的转录因子结合位点预测... 58

4.2.5 LvALS11表达模式分析... 59

4.2.6 LvALS11的RNA干扰实验... 60

4.2.7 LvALS11敲降后的基因表达变化... 61

4.3 讨论... 67

4.3.1 LvALS11的功能... 67

4.3.2 LvALS11对生长可能的影响... 67

4.3.3 本研究的意义... 68

第5章 总结与展望... 69

5.1研究总结... 69

5.2 主要创新点... 69

5.3 存在问题... 70

5.4 研究展望... 70

参考文献... 71

致  谢... 79

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果... 81