实验海洋生物学重点实验室知识库

  急性肝胰腺坏死病 （Acute hepatopancreas necrosis disease, AHPND）是对虾养殖中最常见、最严重的疾病之一，对全球对虾养殖业造成了巨大威胁。该病主要是由携带含有PirA和PirB编码基因的质粒的副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 感染引发的。抗病育种被认为是控制病害最为直接和有效的途径。鉴定对虾抗病相关基因，解析对虾抗病的分子机制，是抗病育种的基础。基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术不但是基因功能研究的重要方法，也是开展高效、精准遗传改良的关键技术支撑。然而由于甲壳动物的基因编辑技术体系不成熟，极大限制了抗病等经济性状关键基因的鉴定和精准遗传操作。本论文一方面针对对虾抗副溶血弧菌性状开展了遗传解析，另一方面以十足目甲壳动物-脊尾白虾为材料建立了基于CRISPR/Cas9的高效基因编辑技术，为虾类抗病关键基因的鉴定和定向抗病育种奠定了重要基础和提供了技术保障。论文的主要进展如下：

        1. 凡纳滨对虾在副溶血弧菌感染前后肝胰腺的比较转录组分析：结果表明，副溶血弧菌感染引起对虾肝胰腺内糖代谢、氨基酸代谢和核酸代谢等代谢过程发生明显变化，涉及的代谢通路主要包括糖酵解、糖异生、戊糖磷酸途径、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢及叶酸—碳库途径。这些途径不仅与能量供应相关，还能为蛋白质、脂质和核酸等的合成提供丰富的前体物质。此外，调控这些代谢过程的HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路和NF-kappaB信号通路中部分基因也会因感染发生明显上调表达。结合感染后肝胰腺弧菌载量的变化，对虾肝胰腺内代谢过程显著变化的时期发生在副溶血弧菌显著增殖的阶段，表明肝胰腺内代谢的紊乱与弧菌增殖密切相关。

        2. 凡纳滨对虾抗性家系和敏感家系肝胰腺的比较转录组分析：为了解对虾对副溶血弧菌抗性的机制，本论文基于课题组通过遗传育种获得的对副溶血弧菌的抗性具有明显差异的家系（抗性家系和敏感家系），比较了它们肝胰腺的转录表达差异，发现参与免疫过程和代谢过程的基因在抗性家系和敏感家系间存在明显的表达差异。在这些差异表达基因中，大部分免疫相关基因在抗性家系中呈现高表达，其主要参与病原相关分子模式识别、病原体的吞噬和清除、活性氧稳态维持等免疫过程。然而，大多数代谢相关的基因则在敏感家系中高表达，主要参与脂质、维生素、辅助因子、葡萄糖和丝氨酸等的代谢过程。进一步比较分析上述差异基因在副溶血弧菌感染后的表达变化，发现免疫相关的差异表达基因在抗性家系仍保持较高的表达水平，而代谢相关的差异基因在敏感家系呈现较高的表达水平。上述结果表明，免疫和代谢相关基因在肝胰腺中的差异表达可能与对虾抗副溶血弧菌的能力密切相关。

        3. 对虾抗病重要功能基因LysM的功能研究：针对上述筛选的差异表达基因LvLysM的功能进行了深入研究。在凡纳滨对虾中共鉴定获得两条编码细胞溶解酶基序（Lysin motif, LysM）的基因LvLysM1和LvLysM2。序列特征分析显示，LvLysM1编码的氨基酸序列仅在N端含有一个LysM结构域，而LvLysM2编码的氨基酸序列在中间含有一个LysM结构域，在C端含有一个跨膜结构域。LvLysM1和LvLysM2在检测的多个组织中均有表达，其中在鳃等免疫相关组织中的表达水平较高。LvLysMs在对虾鳃中的表达会因副溶血弧菌的感染呈上调表达变化。酶联免疫吸附实验表明，LvLysM2的重组蛋白能够与不同的细菌多糖如葡聚糖（GLU）、脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）结合，而LvLysM1的重组蛋白不具有结合活性。利用RNA干扰技术敲降LvLysM1或LvLysM2后，对虾在副溶血弧菌感染后的死亡率显著升高，说明LvLysM1和LvLysM2均具有抗副溶血弧菌感染的能力，但它们发挥作用的方式可能不同。进一步开展了LvLysM1和LvLysM2基因的遗传变异与抗副溶血弧菌性状的关联分析，发现其中一些SNPs与对虾对副溶血弧菌的抗性显著相关。上述结果表明，LvLysM在凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染过程中发挥重要作用。研究结果不仅丰富了对LysM蛋白功能的新认识，也为对虾抗病育种提供了重要标记。

        4. 虾类CRISPR/Cas9基因编辑平台优化及其应用：为构建高效的基因编辑技术，本研究以脊尾白虾为实验材料，对基于显微注射的虾类基因编辑技术体系进行了优化。首先针对虾类CRISPR/Cas9技术显微注射效率低、胚胎存活率低、基因编辑效率低等瓶颈问题，系统优化了基于显微注射的CRISPR/Cas9基因编辑技术平台，显微注射效率、胚胎存活率和基因编辑效率得到显著提高，胚胎存活率从优化前的8%提高到47%，基因编辑效率3%提高到37.5%。进一步克隆了脊尾白虾胰岛素样促雄性腺激素基因——EcIAG，设计并合成了靶向EcIAG的两个单链向导RNA（Single guide RNA, sgRNA）。将sgRNA和Cas9 蛋白混合而成的Cas9核糖核蛋白复合物（Cas9 RNPs）注射到受精卵或第一次核分裂的胚胎中，获得了双等位基因缺失的纯合突变体。雄性纯合突变体表现出雌性性别表型，性成熟后具有功能完整的纳精囊、卵巢等组织，成功实现了雄性脊尾白虾的性别逆转。当性逆转的伪雌性（neo-female）个体与野生型雄性个体交配后，获得了遗传了突变位点的子代群体，首次证实以CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术可以实现虾类的性反转。虾类基因编辑技术的建立，不仅为基因功能研究提供了重要手段，也为基于关键靶基因的虾类定向育种提供了可能。